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            細胞免疫熒光實驗

            發布日期:2023-11-13 17:15:14   瀏覽量 :131
            發布日期:2023-11-13 17:15:14  
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            細胞免疫熒光相對于免疫組化實驗非常簡單,一般是入門實驗,主要目的是用抗體檢測細胞表達的蛋白。

            下面詳細介紹

            一: 細胞培養

            熒光顯微鏡對于直接用培養皿拍攝都沒有什么壓力,不過依然更建議做爬片,不僅效果更好而且更適合拍共聚焦,不想拍了也可以冷凍保存。爬片的預處理需要用多聚賴氨酸增加細胞粘附性

            1,用多聚賴氨酸涂在爬片上放置30-120分鐘。

            2,然后用滅菌的超純水清洗和浸泡,。

            3,自然干燥了之后放在紫外下照射至少1個小時以上。爬片之前經過高溫滅菌的可以不需要這么久。

            4,如果用普通蓋玻片而不是專用細胞爬片的話,一般還需要用0.1% Tween-20的PBS洗一下,因為根據我的經驗,幾個牌子的普通蓋玻片都比較臟,不能直接用。

            5,在培養皿內滴100uL左右的培養基,然后把爬片貼上去,這樣可以貼的很牢固也沒有氣泡。

            6,常規細胞培養,如果你的細胞貼壁能力很強,比如用胰酶都要消化3min以上的,可以不需要第一步。

            二:細胞固定,通透和染色

            這幾個也是免疫組化的步驟,就不用解釋了。直接說流程

            1,4%多聚甲醛孵育細胞10min?;蛘哂梅旁?20℃預冷的甲醇孵育5min。這兩個都是常規固定液,非常規的也有甲醛,乙醇和丙酮等。

            2,用提前在4℃或者冰上預冷的PBS洗三次,不要太用力。

            3,抗原修復。不要驚訝,就是抗原修復?;旧虾苌儆腥藭@么做,但是細胞免疫熒光里增加了抗原修復的步驟會讓抗體更容易染上,很多做不出來的抗體都可以做出來。過程就是堿性尿素緩沖液在95℃水浴10min,自然冷卻即可。

            4,透化。這個步驟取決于你的抗體針對的是不是胞內蛋白,膜蛋白不需要這個步驟。常規透化劑是0.1% Triton X-100的PBS。透化10分鐘然后用PBS洗干凈。

            5,封閉。封閉液可以用溶于PBS的BSA或者二抗物種的血清。BSA的濃度只要1%就可以,血清只要10%即可。如果你是用甲醛類做固定液,那么還需要22mg/ml的甘氨酸添加到封閉液里。如果你的一抗結合力很強或者二抗有非特異性結合,那么添加0.1%吐溫20。

            6,用封閉液稀釋一抗,4℃過夜孵育。第二天用PBST清洗三遍后避光。孵育二抗,二抗濃度大約1抗的十倍。最后染DAPI(1ug/ml)1分鐘。

            7,PBS洗三遍,用抗淬滅封片劑封片。邊緣處滴兩滴指甲油。就可以拍照了。

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